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RCL检测
CAR-T制备中,大多数应用于细胞基因治疗的逆转录病毒和慢病毒均被设计为复制缺陷型病毒载体,并采用多个质粒进行共转染以表达慢病毒或者γ-逆转录病毒。在生产中可能发生经缺失改造的载体与野生型病毒序列之间的同源重组,导致产生复制型病毒,对人体造成严重的威胁,故RCL检测是安全性检测中非常重要的项目之一。
🧬 核心含义
一、RCL检测简介
CAR-T制备中,大多数应用于细胞基因治疗的逆转录病毒和慢病毒均被设计为复制缺陷型病毒载体,并采用多个质粒进行共转染以表达慢病毒或者γ-逆转录病毒。在生产中可能发生经缺失改造的载体与野生型病毒序列之间的同源重组,导致产生复制型病毒,对人体造成严重的威胁,故RCL检测是安全性检测中非常重要的项目之一。
FDA推荐的RCL检测方法是利用敏感细胞对病毒载体中可能存在的RCL进行培养扩增,并在培养终点进行检测。
扩增期:将待测物与对HIV-1易感并且可大量扩增病毒的细胞系( 通常用 C8166) 孵育,细胞传代5次以上,培养至少3周。

指示期:3 周后收集培养上清,接种于C8166 细胞中培养 7d 后检测RCL 标志物。
RCL指示期培养

RCL标准操作流程

检测方法:
A:P24 ELISA 的方法:适用于由载体制备过程中病毒基因组之间的重组形成 RCL 的检测。
B:PERT法:当 RCL 进行扩增后,也可应用PERT检测方法测定逆转录酶活性。该方法的缺点是在某些细胞中存在高背景。
C:qPCR方法:采用实时定量 PCR 方法( Q-PCR) 测定假型病毒 VSV-G 复制过程中的 VSV-G 基因序列或检测由载体质粒和包装质粒重组产生的psi-gag序列。
二、RCL检测方法分析
美国FDA 2020年发布的关于RCR/RCL检测指南提出:对于RCR/RCL的检测包含指示细胞培养法、ELISA法(p24蛋白测定)、PCR/Q-PCR法(通过psi-gag或VSV-G聚合酶链反应)、PERT法(产物增强性逆转录检测法)共4种检测方法。
复制型慢病毒RCL的指示细胞培养法检测需28天,耗时较长;而基于VSV-G序列的Q-PCR方法和基于gag序列的PCR方法具有检测时间短、灵敏度高、可重复性强等优点。目前,许多CAR-T申报企业采用Q-PCR/PCR方法直接测定终产品中的VSV-G序列或psi-gag序列,作为快速放行方法。
上海合佑生生物科技有限公司结合市场需求和技术平台优势,在ELISA法(p24蛋白测定)、Psi-gag序列区域的PCR法或VSV-G聚合酶链反应法等方法积累开发经验。欢迎广大客户垂询。
全国免费咨询电话:021-36696819
1、ELISA 法( p24 蛋白测定)

通过预先包被HIV-1核心抗体的96孔板在底物TMB以及过氧化根的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下最终转化成黄色。使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。
b)定量分析、灵敏度高
使用标准品绘制标准曲线, 计算样品中的p24蛋白浓度以及进行RCL检测。P24 ELISA 法灵敏度可达到3pg/ml。
c)适合多种样本
P24检测可检测终末细胞、浓缩载体、血清血浆等多种样本。本平台具有严格的Cut off判断标准,以保证试验结果的准确性、有效性和可重复性。

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