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体外分化的Th1/Th17/Treg细胞

CD4+辅助性t淋巴细胞(helper t cell,th)是细胞免疫的介质,在活化其他免疫细胞(如B细胞和细胞毒性T细胞)以及调节免疫反应中起着关键作用。

抗体介导的细胞毒性实验(ADCC)

抗体作为免疫系统的组成部分,在抵御疾病中发挥重要的作用。抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependentcell-mediated-cytotoxicity,ADCC),是抗体发挥作用的方式之一,当IGG抗体通过Fab段与靶细胞(病毒感染的细胞及肿瘤细胞)表面抗原决定簇特异性结合后,其Fc段可与有FcR的杀伤细胞(NK细胞、单核-巨噬细胞、中性粒细胞)等效应细胞结合,触发效应细胞的杀伤活性,直接杀伤靶细胞(病毒感染的细胞及肿瘤细胞)。能够对靶细胞产生ADCC效果是靶向癌相关抗原的抗体候选分子的一个重要功能性指标。

抗体依赖的细胞吞噬作用

ADCP是抗体药物靶向治疗肿瘤等疾病的作用机制之一,当前以增强巨噬细胞对治疗性抗体反应为目的的治疗策略已引起研究者的重视,包括探寻新的靶点和研发具有更强功能的抗体等。

补体依赖的细胞毒性作用(CDC)

补体是存在于人或脊椎动物血清与组织液中的一组不耐热的,经活化后具有酶活性的蛋白质,包括30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白。补体依赖的细胞毒性作用(Complement Dependent Cytotoxicity, CDC)是补体通过特异性抗体与细胞膜表面相应抗原结合,激活补体经典途径,形成的攻膜复合物裂解靶细胞的作用。抗体与补体C1q首先结合,接着C2-C9就被激活形成攻膜复合物对靶细胞发挥裂解效应。

细胞因子风暴风险评价(CRS)

细胞因子释放综合征(CRS)是机体感染病原微生物后,免疫系统“反应过度”所致。感染后,短时间内多种细胞因子如 TNF-α、IL -1 等大量产生,众多免疫细胞被激活并释放海量细胞因子,进而引发严重全身炎症反应综合征。这些过量细胞因子会攻击自身组织器官,造成损害并诱发多种临床表现,严重影响患者健康。目前,针对 CRS 常规措施聚焦于对引发细胞因子风暴的关键细胞因子进行调控干预 。

基于流式的细胞表征实验(FACS)

抗体药物的靶点主要是细胞表面与疾病相关的抗原或特定的受体分子。通过流式细胞仪测定细胞的阳性群来检测配体与抗体的竞争结合情况。选用携带抗原的细胞进行检测,细胞表面的抗原空间节后更接近体内存在形式,使待测结果更接近实际情况。

RCL检测


CAR-T制备中,大多数应用于细胞基因治疗的逆转录病毒和慢病毒均被设计为复制缺陷型病毒载体,并采用多个质粒进行共转染以表达慢病毒或者γ-逆转录病毒。在生产中可能发生经缺失改造的载体与野生型病毒序列之间的同源重组,导致产生复制型病毒,对人体造成严重的威胁,故RCL检测是安全性检测中非常重要的项目之一。

🧬 核心含义

 

一、RCL检测简介

 

CAR-T制备中,大多数应用于细胞基因治疗的逆转录病毒和慢病毒均被设计为复制缺陷型病毒载体,并采用多个质粒进行共转染以表达慢病毒或者γ-逆转录病毒。在生产中可能发生经缺失改造的载体与野生型病毒序列之间的同源重组,导致产生复制型病毒,对人体造成严重的威胁,故RCL检测是安全性检测中非常重要的项目之一。

 

FDA推荐的RCL检测方法是利用敏感细胞对病毒载体中可能存在的RCL进行培养扩增,并在培养终点进行检测。

 

扩增期:将待测物与对HIV-1易感并且可大量扩增病毒的细胞系( 通常用 C8166) 孵育,细胞传代5次以上,培养至少3周。

 

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指示期:3 周后收集培养上清,接种于C8166 细胞中培养 7d 后检测RCL 标志物。

 

RCL指示期培养

 

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RCL标准操作流程

 

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检测方法:

A:P24 ELISA 的方法:适用于由载体制备过程中病毒基因组之间的重组形成 RCL 的检测。

B:PERT法:当 RCL 进行扩增后,也可应用PERT检测方法测定逆转录酶活性。该方法的缺点是在某些细胞中存在高背景。

C:qPCR方法:采用实时定量 PCR 方法( Q-PCR) 测定假型病毒 VSV-G 复制过程中的 VSV-G 基因序列或检测由载体质粒和包装质粒重组产生的psi-gag序列。

 

二、RCL检测方法分析

 

美国FDA 2020年发布的关于RCR/RCL检测指南提出:对于RCR/RCL的检测包含指示细胞培养法、ELISA法(p24蛋白测定)、PCR/Q-PCR法(通过psi-gag或VSV-G聚合酶链反应)、PERT法(产物增强性逆转录检测法)共4种检测方法。

 

复制型慢病毒RCL的指示细胞培养法检测需28天,耗时较长;而基于VSV-G序列的Q-PCR方法和基于gag序列的PCR方法具有检测时间短、灵敏度高、可重复性强等优点。目前,许多CAR-T申报企业采用Q-PCR/PCR方法直接测定终产品中的VSV-G序列或psi-gag序列,作为快速放行方法。

 

上海合佑生生物科技有限公司结合市场需求和技术平台优势,在ELISA法(p24蛋白测定)、Psi-gag序列区域的PCR法或VSV-G聚合酶链反应法等方法积累开发经验。欢迎广大客户垂询。

 

全国免费咨询电话:021-36696819

1、ELISA 法( p24 蛋白测定)

 

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通过预先包被HIV-1核心抗体的96孔板在底物TMB以及过氧化根的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下最终转化成黄色。使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。

 

b)定量分析、灵敏度高

使用标准品绘制标准曲线, 计算样品中的p24蛋白浓度以及进行RCL检测。P24 ELISA 法灵敏度可达到3pg/ml。

 

c)适合多种样本

P24检测可检测终末细胞、浓缩载体、血清血浆等多种样本。本平台具有严格的Cut off判断标准,以保证试验结果的准确性、有效性和可重复性。

 

 

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