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常见问题解答

 

1、T细胞可以传代吗？

T细胞不可以传代，但是添加刺激剂之后可以扩增，可以激活扩增，激活有多种方法，如PHA/PMA/SEB/CD3 CD28等，常规的激活扩增方法为CD3/CD28激活磁珠。

2、为什么T细胞全飘起来了，是不是死了？

T细胞及所有的淋巴细胞都是悬浮细胞，不贴壁，只要镜下观察细胞形状均匀透亮，细胞计数活性高，细胞状态就没问题。

3、T细胞激活扩增的方案？

主要含10%FBS的1640加入CD3/CD28激活磁珠和一定浓度的IL-2，若有条件选用无血清培养基更好。

4、PBMC可以传代吗？

不可以。PBMC是由多种亚型细胞混合的，包括淋巴细胞（TBNK）和单核细胞，并非是单一细胞，PBMC里所有的亚型细胞都不可以传代。但部分细胞可以诱导分化，部分细胞可以激活扩增。

可诱导分化的细胞：单核细胞，外周血中单核细胞无扩增能力，但可以通过细胞因子诱导DC(树突状细胞）和巨噬细胞（包括M0型，M1型和M2型）

可以激活扩增的细胞：T细胞，NK细胞。

5、PBMC收到后可以维持培养吗？可以养几天呢？

常规建议复苏后直接使用，PBMC体外培养时间越长，细胞状态越差，很多细胞会逐渐凋亡。有部分客户会过夜培养恢复细胞状态，一般过夜后活性略有下降是正常现象。若有特殊需求需要维持培养可以使用含10%FBS的1640培养基进行维持培养，建议2-3天内使用，不要超过一周。如果客户需要其中某种特定的亚型细胞，可以按照相应的实验方案进行实验。

6、T细胞激活不起来

不同的批次会有批间差异，但以目前合佑生积累的实验数据来看，大部分批次在CD3/CD28磁珠激活的情况下都是可以正常扩增的。

7、单核细胞不贴壁

冻存对单核细胞的功能会有一些影响，批次间差异较大。如果是诱导DC或者Macrophage可建议用新鲜样本，合佑生在持续优化单核冻存工艺，后续也会提供单核诱导筛选过的批次，确保收到单核功能更好的样本。

8、PBMC分离注意事项和得率

Ficoll在梯度密度离心时适宜温度是18-22℃，温度过高或过低都会严重影响分离后的细胞状态，正常得率在60%-80%之间。

9、单核诱导Macrophage/DC的得率

50%-60%左右。

10、新鲜细胞为什么是黄色的？PBMC中的细胞碎片和血小板问题？

新鲜PBMC中添加了一些自体血浆（浓度15%左右，颜色会偏黄）血浆中有大量蛋白，可以保护细胞状态更好，后续会将血浆浓度降低到10%左右。细胞中有少量细胞碎片存在是正常的，血小板是由于不同的单采机采出来的细胞中会有一些血小板量的差异，一般不会影响实验结果。

11、实验室检测无菌、支原体的方法

无菌检测：平板涂布培养法（培养14天）

支原体：显色法

 

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