从Leukopak到PBMC
什么是Leukopak?
Leukopak是一种通过单采机收集的富集血液分离产物，主要目的是从外周血中提取白细胞（WBC）。白细胞含有高浓度的单核细胞（PBMC），主要由T细胞，B细胞，NK细胞和单核细胞组成。Leukopak中的白细胞浓度明显（约4-7*108白细胞/毫升）比全血（平均值 5-7*106白细胞/毫升）高很多。此外，白细胞中的红细胞（RBC）浓度显着降低，比例约为每2个红细胞1个WBC，而在全血中，比例约为每1000个红细胞约1个WBC。
而且白细胞纯度和质量与全血相比要优越得多，通常含有20倍以上的单核细胞含量。PBMC因其在免疫治疗研究，细胞治疗工艺开发和临床中的应用而受到高度重视。因此，白细胞已成为细胞治疗研究和药物开发的首选起始材料。
高品质的Leukopak是纯度和产量的完美平衡。实现这种平衡不仅需要血液分离专业知识，还需要对捐赠者的良好管理。通过对捐赠者的饮食和生活习惯指导，我们可以最大限度地提高捐赠者白细胞的潜在质量。
然而，即使是高质量的白细胞在产量方面也是可变的。捐赠者与捐赠者之间的可变性是固有的，而且往往不可预测的。然而，这种自然变异性肯定会出现在患者群体中，并且在工艺开发过程中必须被接受和考虑。
外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，是外周血中具有单个核的细胞，来源于骨髓中的造血干细胞(HSC)。HSC通过造血过程产生免疫系统的所有血细胞。HSC可以分化成两个谱系：髓系(单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、巨核细胞、树突状细胞、红细胞) 和淋巴系(T 细胞、B 细胞、NK 细胞) 。
而PBMC主要包括淋巴细胞和单核细胞，淋巴细胞又细分为T细胞，B细胞，NK细胞等。
图1、PBMC中各细胞比例
|
细胞名称 |
比例 |
|
单核细胞 |
10-30% |
|
淋巴细胞 |
70-90% |
|
总T细胞 |
30-70% |
|
B细胞 |
5-15% |
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NK细胞 |
5-10% |
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树突状细胞 |
1-2% |
图2、PBMC中各细胞常用表面标志物
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CD3 |
T淋巴细胞 |
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CD4 |
辅助T细胞 |
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CD8 |
毒性T细胞、部分NK细胞 |
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CD14 |
单核细胞 |
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CD16 |
NK细胞 |
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CD19 |
B淋巴细胞 |
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CD34 |
造血干细胞 |
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CD45 |
白细胞 |
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CD56 |
NK细胞、某些T细胞 |
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CD66b |
粒细胞 |
03如何高效地从Leukopak中获取PBMC
通常，从Leukopak中获取PBMC会通过梯度密度离心的方法，由于Leukopak中各细胞密度不同，我们选择密度为 1.077g/ml 的淋巴分离液，在离心管中将血样轻轻加到淋巴分离液上层，经过离心之后会形成四层分层：
最下层是红细胞和粒细胞混合
第二层淋巴分离液
第三层由 PBMC 和血小板组成
最上层为血浆
在使用梯度密度分离的过程中，有一些细节可能会影响分离的PBMC的纯度、得率以及细胞质量。
下面我们简要介绍分离过程中的注意事项：
1、 收到血样后建议先对Leukopak进行白细胞计数，大概确定血样中白细胞的数量。
2、 分离前根据成分血体积在成分血中加入PBS进行1:2稀释（一般建议1/3PBS+2/3血样）。
3、 一般 1支 50 mL 离心管建议加入10-20 mL 稀释后的血样，先加入 15-20 mL 淋巴细胞分离液，然后将稀释的血液延壁轻轻加到分离液的上层。（此时血样不建议加入太多，也不建议加入太少。加入太多，更易发生红细胞粘连情况，影响分离后的纯度，加入太少可能会损失部分白细胞，影响得率）
4、 进行梯度密度离心时，注意离心机温度要控制在20-22度，温度太低会严重影响PBMC得率，同时，在分离过程中，务必关闭离心机刹车，使离心机以中等升速，缓慢降速的状态运行。
5、 离心后收获中间白膜层PBMC，由于白膜层不可避免有挂壁现象发生，需用移液管将壁上细胞刮下，保证PBMC得率。
6、 如需去除血小板，可在细胞沉淀中加入DPBS，混匀后以250g-300g*10min,关闭刹车的条件进行离心，但去除血小板的过程中不可避免会损失一些目的细胞。
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