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细胞计数

我们的日常实验中，有大量需要计算细胞密度，从而进一步计算接种浓度或数量的情况。
 

常用的细胞计数方法有：血球计数板计数法，细胞计数仪计数以及流式绝对计数法等。

血球计数板计数，方便，快捷，所需材料少，成本低，大多数实验室条件皆可满足，但由于计数受人工操作影响较大，且不同的血球计数板精度不同，容易造成计数结果有较大差异。
细胞计数仪计数较为稳定，市面上的多种品牌自动细胞计数仪，有基于细胞图像的，也有基于coulter原理的，主要目的就是将人工从繁冗无聊的手工计数中解放出来，排除操作者的主观性。

流式绝对细胞计数一般通过两种方法，一种是将来自血细胞分析仪中独立的细胞浓度测量装置与流失细胞分析的群体数据相结合（多平台检测），另一种向流失细胞样品中加入内部微球计数标准品（单平台检测）。

 

 

 

 

 

常用的细胞活性检测法有台盼蓝染色法，双荧光染色法等，这些细胞计数和活力检测的方法各自有其优缺点。

台盼蓝染色的原理是细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。 而活细胞能阻止染料进入细胞内。台盼蓝是一种具有毒性的化学染料，若染色时间过长除了死细胞也会渗入活细胞，降低细胞的存活率。

AO可以通过完整的细胞膜，嵌入所有细胞（活细胞和死细胞）的细胞核，呈现绿色荧光；PI 只能通过不完整的细胞膜，即死细胞的细胞膜，嵌入所有死细胞的细胞核，呈现红色荧光。 当两种染料均存在于细胞核内，在合适的 AO、PI 配比下，两种染料发生能量共振转移，致活细胞在蓝色通道下激发出绿色荧光，死细胞在绿色通道下激发出红色荧光从而得出细胞的活性，但荧光染色法需要通过专业的细胞计数仪或流式细胞仪才能获得结果，对设备要求较高。

 

 

 

 

影响细胞计数及活性的一些因素
针对同一样品应重复计数三次以验证取样的稳定性。
对于冻存细胞，正确进行细胞复苏有助于提高细胞活性，不当的细胞复苏操作（如水浴锅中水过少，复苏时间过长、冻存管中残留较大冰晶就取出冻存管等）会影响细胞活性。
验证移液枪的准确性 可以使用去离子水标准品（吸取 100ul = 100 mg），吸取后放在精确的称量器上称量。
吸取液体前应先吹打一下润湿枪头，对于液体粘度较大的液体需要使用反向取法，使用移液枪将吸样按钮打第二档吸取样品，然后将按钮推至第一档将液体排除，余下液体弃用。
使用移液器取样时尽量避免有气泡产生，减少取样误差。
建议对离心后的细胞沉淀先加少量体积的Buffer进行吹打重悬，保证细胞能均匀分布在Buffer中再使用大体积Buffer混匀，防止细胞结块未能完全吹开。
细胞的绝对计数受设备的影响非常大，通常需要校正才能准确使用。
血球计数板的准确性是由刻画精度决定的。 
由于AO和PI是核酸染料，只能对有核细胞着色，故其计数结果会略低于白光视野下的观察结果。
台盼蓝具有细胞毒性毒性，细胞活性与染色时间长短，台盼蓝浓度有很大关系，操作不当计出的活性结果可能会偏低。
计数时由于染料会稀释细胞样本，应扣除稀释倍率。
细胞计数浓度应保证在细胞计数仪的有效计数浓度范围之内，避免造成较大误差。

 

 

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