小“生”有理（六）|基于树突状细胞的多肽和mRNA疫苗免疫原性测定
发布时间：
2024-04-12 17:32
背景简介
多肽和mRNA因更强的适应性已显示出其在疫苗大规模应用的巨大潜力，可用于对抗快速突变的病毒或高度异质性的癌症类型，这是基于它们目前已建立的不同表位序列的自动化合成。
与减毒病原体相比，蛋白质和多肽通常表现出降低的免疫原性。为了用这些亚单位疫苗进行有效的治疗，正确选择抗原，且与免疫细胞刺激佐剂进行精确的联合递送都很重要。可使用引起强烈的先天性和适应性免疫刺激的Toll样受体（TLR）激动剂。这些激动剂包括核酸佐剂（聚（I:C）-TLR3和CpG-TLR9）以及小分子激动剂，如咪唑并喹啉（TLR7/8）。这些激动剂与抗原呈递细胞（APC），如树突状细胞（DC）的内涵体膜上表达的TLR结合，导致其成熟和MHC-I和II表达的上调，此外还有共刺激信号传导和促炎细胞因子的释放，从而导致其他免疫细胞的下游激活。基于其向T细胞呈递外源抗原的能力，APC样树突状细胞的激活和成熟是引发有效免疫反应的先决条件。这一过程被称为交叉呈递，导致抗原特异性细胞毒性CD8+T细胞的诱导，这些细胞对消除恶性肿瘤细胞至关重要。除了CD8+细胞表位外，基于多肽的疫苗还必须包含CD4+T细胞的表位，以确保抗原特异性T辅助细胞的产生。这些T细胞辅助细胞与抗原特异性CD8+T细胞的相互作用对于激发有效的细胞免疫是必要的。
与全蛋白相比，除了更便宜便捷的生产制备外，多肽抗原还允许对特定（例如突变）表位进行序列选择性调节。特别是在靶向患者特异性肿瘤新抗原时，多肽抗原可以根据个人的新抗原库进行定制。由于其完全合成的特性，它们还通过降低病原体和毒素污染的风险来提高药物安全性。
DC在诱导适应性反应中起着关键作用，可激活幼稚的T细胞，此外，他们通过整合各种刺激来引导这些适应应性免疫反应，来自不同病原体相关分子模式和细胞因子环境的刺激。未成熟DC细胞能够摄取蛋白质抗原，而成熟DC细胞是幼稚T细胞多肽的有效呈递者。人的DC细胞易从外周血单核细胞中培养，单核细胞从人血液中分离的。疫苗开发过程中，需要以高通量的方式监测候选疫苗的免疫原性。此外，监管机构要求对释放进行有效性和安全性测试。部分疫苗测试需要动物，过程会引起疼痛和不适，也会干扰测试结果。为促进疫苗开发和减少批量释放测试的动物数量，建议更广泛地使用人DC进行疫苗免疫测试，DC细胞已日渐成熟应用于测试疫苗和辅助免疫原性。
树突状细胞（DC）是能够启动细胞免疫反应的前哨细胞。它们表现为能够很好地摄取蛋白质抗原的未成熟DC细胞和成熟DC细胞能够将多肽呈递给幼稚T细胞。与T细胞和B细胞相比，DC细胞是抗原非特异性的，因此基于DC的测定并不测量抗原特异性反应，而是测量对与疫苗（成分）的病原体相关分子模式（PAMP）的反应。PAMP由DC细胞高度表达的模式识别受体（PRR）检测。PRR可以位于细胞表面，细胞内室或者细胞质中。重要的是，随后的免疫反应的性质在很大程度上受疫苗刺激的PRR（或不同PRR的组合）以及细胞因子环境的影响。通过这种方式，它们在先天免疫反应和适应性免疫反应之间形成了重要的联系。DC有几种类型，最常见的分类是髓系DC和浆细胞样DC。髓样DC（mDC）是一种特殊的抗原处理和呈递细胞，与未成熟细胞一样具有较高的吞噬细胞活性，与成熟细胞一样具有较高的细胞因子产生能力。它们在稳态和感染期间调节T细胞反应。浆细胞样DC（pDC）专门通过产生I型干扰素来应对病毒感染。它们也可以作为抗原呈递细胞并控制T细胞反应。在疫苗开发过程中，监测其免疫原性至关重要。例如，在过敏疫苗的情况下，许多疫苗（过敏原）正在研发中，其中只有极少数具有足够的免疫原性。测试所有这些候选疫苗需要许多实验动物。此外，对于批量发布，监管机构要求区分不同疫苗成分的原理。
测试每批疫苗的有效性和安全性。疫苗测试需要大量的动物，过程会经历疼痛和不适。DC在诱导保护性免疫中发挥着重要作用。因此，尝试使用DC来评估疫苗免疫原性并通过测量DC成熟度来进行评估似乎是显而易见的。人类DC细胞易从人类血液中获得，避免了跨物种推断和实验室动物的使用。基于人类DC的体外试验在疫苗免疫原性测试中的成功应用，即DC成熟，以及更先进的方法，如内溶酶体降解和DC/T细胞共培养，提倡使用基于人DC的测定法评估疫苗开发的疫苗免疫原性，并作为批量释放动物试验的替代方法。
使用树突状细胞的体外测定的实例
区分Hib疫苗的各种成分。通过基因图谱将各种细胞系与单核细胞衍生的DC（moDC）进行比较，发现MUTZ-3细胞系与moDC最相似。使用该细胞系，我们能够显示出乙型流感嗜血杆菌（Hib）抗原多糖基核糖醇磷酸酯（PRP）、门尼瑟菌外膜蛋白（OMP）以及PRP和OMP之间的偶联物体外处理后，表面标记物表达和细胞因子产生的差异。该偶联物是实际的疫苗；将缀合物与最终产物（用铝作为佐剂）进行比较没有显示出表面标记物表达或细胞因子产生的差异。尽管结合过程是常规生物化学监测的，这意味着实际上不需要使用体外测定来监测这一过程，但该方法确实证明了使用这种体外测定可以。使用moDC也可以相当类似地显示疫苗成分之间的不同反应。MUTZ-3细胞系的优点是它易于获得、安全并且显示出最小的变异性。与MUTZ-3细胞系相比，moDC的优点是其较宽的动态范围，并且它具有功能性Toll样受体（TLR）4，而MUTZ-3细胞系显示出来自TLR4的较差信号转导。
总之，基于它们的免疫原性，可以使用MUTZ-3细胞和moDC来区分糖抗原PRP、细菌抗原OMP和缀合物PRP-OMP。
YF-17D热减毒活疫苗的疗效。热减毒活疫苗YF-17D是一种高效疫苗。YF-17D有效诱导CD80和CD86的表达，并诱导IL-6、TNF-α、MCP-1（CCL2）、IP-10（CXCL10）和IL-12p40的产生。IL-12p70也被诱导，但需添加CD154。此外，YF-17D诱导人pDC产生IFN-α。本研究证实了YF-17D的高效性。为了研究其潜在机制，研究了YF-17D对Tlr敲除小鼠DC的影响。缺乏Tlr2、Tlr7或Tlr9显示出IL-12p40的产生明显减少，这表明这三种Tlr以协同方式发挥作用。总之，其对表面标志物表达和细胞因子产生的影响证实了YF-17D的高效性。
评估佐剂免疫原性。CoVaccine HTTM佐剂增加了moDC上CD83和CD86的表达，但没有增加CD11cCD80或MHCII的达。此外，与CoVaccine-HTTM佐剂孵育增加了IL-6的产生，减少了IL-10的产生，而IL-1β、IL-12p70和TNF-α的产生不受影响。IL-6的产生几乎被抗TLR4抗体完全消除，但没有被抗TLR2抗体完全消除。沿着这条线，IL-10的减少被抗TLR4而不是抗TLR2治疗逆转。
在这项研究中，体外DC测试被证明对筛选佐剂的是有价值的。这样的筛选将允许比较不同佐剂的效果以及与佐剂相关的潜在安全问题。
IFN-β预处理可增强BCG的免疫原性。牛分枝杆菌Calmette Guérin（BCG）提供了可变的保护性免疫力，促使人们需要新的结核病疫苗。BCG感染的DC表现出CD38、CD83、CD86和HLA-DR的表达增加，尽管与结核分枝感染的DC相比这种增加较低。此外，BCG感染DC的IL-12p70产生、IL-12p35和IFN-β表达低于结核分枝杆菌。IL-12p35的表达受IFN调节因子-3（IRF-3）的调节，事实上，IRF-3磷酸化是由结核分枝杆菌感染而不是BCG感染诱导的。体外用IFN-β预处理DC导致CD38、CD83和CD86的更强表达和IL-12p70产生。最后，DC的IFN-β预处理导致幼稚异基因脐血淋巴细胞产生IFN-γ和TNF-α的增加。这项研究表明，体外DC测定也可用于测试通过添加细胞因子来提高疫苗免疫原性，为改进疫苗在人体内的使用提供线索。
内溶酶体降解作为疫苗免疫原性的衡量标准。Egger等人的方法基本原理是蛋白质的免疫原性与其对内溶酶体蛋白水解的较低易感性之间的联系。使用具有不同能力的结构相关蛋白质组在体内诱导T细胞反应，作者能够显示体内T细胞启动与体外模拟的内溶酶体蛋白酶易感性之间的联系。使用moDC和鼠骨髓来源的DC获得的结果相似。因此，作者还使用了小鼠DC细胞系JAWSII.13。该细胞系显示出可比较的结果。这是一种非常有前景的免疫原性测试方法。这种方法和DC成熟度的测量之间，进行并排比较似乎非常有用。
使用纯化的DC和原始CD4+T细胞的共培养物测量疫苗免疫原性。在大量外周血单核细胞（PBMC）中，DC的数量可能过低，或处于不适合诱导原代T细胞反应的激活状态。因此，使用了纯化的DC和CD4+T细胞的组合。该方案包括用YF-VAX®（YF-17D的商业制剂）脉冲DC，在体外将DC与CD4+细胞共培养14天，并用YF-VAX刺激7小时之后确定CD4+CD154+IFNγ+细的百分比。该方案使阳性细胞百分比从0.4%增加到3.2%。值得注意的是，YF-VAX®疫苗接种后6至12周，阳性细胞百分比仅增加1.2至2.6倍。此外，体外方案导致CD4+CD154+细胞产生除IFN-γ外的其他细胞因子，如TNF-α、IL-5、IL-17和IL-21。该方案被证明对启动幼稚T细胞具有比传统的基于PBMC的测定高得多的灵敏度，即使在向PBMC中添加DC之后也是如此。
尽管这种方法在高效疫苗中被证实，在低效疫苗中的性能有待确定，但它在评估疫苗免疫原性的方法中非常有前景，一个重要的优势是它不是基于DC成熟，而是基于其功能结果，即CD4+细胞扩增。同样，在这种方法和DC成熟度的测量之间进行并排比较似乎非常有用。
使用人moDC的体外试验能够很好地测试疫苗免疫原性，此外，相对于体内已知的效果，评估体外对DC的影响有助于理解诱导免疫反应。这些测定可能大大有助于减少疫苗开发过程中的动物试验以及批量释放。体外检测可能有助减少免疫性测试的时间和成本，开发过程中尤为重要。为了正确评估基于DC的测定值，应测试一系列不同的细菌和病毒疫苗、减毒活疫苗和灭活疫苗以及佐剂。这些测试应包括评估检测疫苗批次之间免疫原性差异的能力，以及高通量能力的潜力。更先进的方法，如测量内溶酶降解和使用DC/T细胞共培养物，应与DC成熟并排进行较。
总之，我们建议应更广泛地评估使用人DC进行体外免疫原性测试，目的是增加对疫苗诱导的免疫反应了解，减少实验动物的使用并提高产量。
小“生”有理！
mRNA/多肽体外免疫原性预筛&供者预筛服务
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