流式细胞术
流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。流式细胞术在日常实验中应用十分广泛。本文简要介绍一下流式细胞术的基本原理及常用荧光素如何选择。
流式细胞仪（Flow cytometry ,FCM）是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。概括来说，流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。
流式细胞仪的结构一般分为3部分：液流系统、光学系统和信号检测与分析系统。
1、 液流系统
液流系统是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交，流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是将样品流环包，鞘液流是一种稳定流动，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息，鞘液可以避免堵塞喷孔，同时维持细胞活性。
2、 光学系统
光学系统主要包括激光器和滤光片。目前台式流式细胞仪，大多采用氩离子气体激光器。激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。
常见的激光主要有：
紫色Violet 405nm波长的激光
蓝色Blue 488nm波长的激光
绿色Green 561nm波长的激光
红色Red 633nm波长的激光
滤光片主要分成3 类：长通滤片（long-pass filter, LP）、短通滤片（short-pass filtr, SP）及带通滤片（band-pass filter, BP）。
（1）长通滤片：长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。如LP500滤片，将允许500μm 以上的光通过，而500μm 以下的光吸收或返回。
（2）短通滤片：与长通滤片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或返回。如SP500 滤片，将允许500μm 以下的光通过，而500μm 以上的光吸收或返回。
（3）带通滤片：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如BP500/50 表示其允许通过波长范围为475μm-525μm。
3、信号检测与分析系统
当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，受激光激发，产生代表细胞内不同物质、
不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360 度立体角发射，产生散射光和荧光信号，电子系统将模拟信号转化为数字信号，计算每个脉冲峰的高度、宽度和面积，并和计算机连接以传出数据。
（1）散射光信号：散射光分为前向角散射（forward scatter,FSC）和侧向角散射（sidescatter,SSC），散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理参数或称固有参数。
① 前向角散射：前向角散射与被测细胞的大小有关，确切说与细胞直径的平方密切相关，通常在FCM 应用中，选取FSC 作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。
② 侧向角散射：侧向角散射是指与激光束正交90o 方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。
图1、流式细胞仪的散射光图
（2）荧光信号：当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量。
图2、激光的作用原理
图3、流式细胞分析的操作流程
新鲜实体组织样本可以通过机械法，酶消化法，化学处理法来处理，外周血样本主要可以通过梯度密度离心或者PBMC或者是红细胞裂解液裂解后获得白细胞的方法来处理。针对不同品牌的裂解液有不同的裂解条件，可以按照说明书的方案来操作。
通常情况下裂解后的外周血样本分为明显的三群，粒细胞群，单核细胞群，淋巴细胞群。而新鲜单采样本中粒细胞含量很少，主要分为淋巴细胞群和单核细胞群两群。
图4、新鲜单采裂红后上机效果 图5、全血裂红后上机效果
注意，当我们下一步实验涉及到胞内或者核内染色时，应该尽量使用分离出的PBMC来进行流式染色，避免裂红对细胞状态的影响。
图4、单细胞染色的操作步骤
在进行单细胞悬液染色时，应注意荧光素的选择。可以遵循以下几个原则：
1、根据机器配置选择荧光素：多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配。常用的四色搭配：FITC, PE, PerCP, APC。
2、根据抗原表达强弱合理分配荧光素：第一层次抗原：这一类抗原通常表达稳定且大多呈高表达状态。如果该类抗原为高表达的话，可以将其与荧光强度较低的荧光素抗体相结合，如 Alexa Fluor 700，Brilliant Violet570TM，Brilliant Violet 785 TM 或 APC-Cy7。 第二层次抗原：这类抗原对于进一步表型鉴定至关重要，但是在平行实验中表达量也会有所变化。该类抗原表达水平多变，通常适合与中度荧光强度的荧光素抗体结合，如 Brilliant Violet 510TM，Brilliant Violet 650TM，FITC 或 PerCP-Cy5.5。 第三层次抗原：这类抗原有可能在不同样本中表达差异很大甚至表达量未知。通常针对这类抗原市面上只有纯化抗体，且其搭配的荧光素类型也较少。对于这类抗原的检测要尽量选择荧光素强度最强的荧光素抗体，如 Brilliant Violet 421TM，PE，APC 或 PE-Cy7。
3、选择光谱重叠小的荧光素：尽量选择光谱重叠小的荧光素，如 FITC/PE-Cy7;选择不同激光激发的荧光素，如 FITC/APC, PE/APC。
4、尽量避免偶联染料使用带来的假阳性。偶联荧光染料是指两种荧光素联接在一起进行荧光共振能量转移。若使用偶联的荧光素，务必要在短时间内尽快完成实验，曝光时间越长，荧光素就越不稳定。
染色的荧光强度与染色指数有关，染色指数越高，荧光强度越高，染色指数越低，荧光强度相对更差。按照染色指数由强到弱来排布，PE＞APC＞FITC＞Percp。
参考文献：王书奎《使用流式彩色图谱》
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